020-28106313
行业动态
News
联系我们
Contact Us

联系人:
华南区域经理秦小姐:13826285746

华东区域经理赵小姐:18521501937


传真:020-80672912
网址:www.nagochina.com

地址:
广州市白云区北太路1633号广州民营科技园科兴西路13号自编B2栋四楼

公司动态
您当前位置:首页 > 行业动态 > 公司动态 >

【艾卓课堂】一次加菌和三次加菌的防腐效能研究

发布时间:2020-08-03 11:42:08

化妆品在生产和使用过程中极易受到微生物的污染,因此化妆品需要提前做好防腐性能测试,而化妆品防腐剂的防腐效能一般通过微生物防腐挑战性实验进行评定。

 

目前国内外使用的防腐效能评价方法有很多,包括:欧洲药典EP 5.0(5.1.3微生物防腐功效)、美国药典USP 43〈51〉微生物防腐功效测试、英国药典BP附录XVIC(C5.1.3)微生物防腐功效、CTFA M-3(2001)水溶性化妆品防腐功效测试、ASTM E640-2006水溶性化妆品防腐测试方法等。

 

按照微生物防腐挑战性实验的接菌方式分类,可分为一次加菌方法和重复三次加菌方法。

本文参考美国药典USP43<51>一次加菌(28天)微生物挑战性实验方法和CTFA推荐的重复三次加菌(42天)微生物挑战性实验方法。根据不同类型化妆品的生产和使用特点,在对生产过程的微生物进行严格控制的情况下,探究一次加菌和三次加菌微生物挑战性方法在不同化妆品类型(贴布式面膜和润肤乳)中的应用。

注:一次加菌和三次加菌的微生物挑战性实验的实验材料和实验步骤相同,故以下仅分写实验方法、评判标准及实验结果。

 

 

一次加菌的28天微生物挑战性实验

 

实 验 方 法

此方法参照美国药典(第39版) 上微生物挑战性测试,称取各受试样品30g于灭菌的样品瓶中,加入定量的混合菌悬液, 要求样品中的细菌初始加菌浓度为1.0×105-106cfu/g;酵母和霉菌初始加菌浓度为1.0×104-105cfu/g。然后充分混匀, 用封口胶封好样品瓶口,置于28℃左右的培养箱中。在接菌的7、14、21和28天取样分析。

评 判 标 准

(1)细菌总数从初始到第7天的细菌数对数减少值不能小于1.0;细菌总数从初始到第14天的细菌数对数减少值不能小于3.0;并且从14天到28天细菌数不增加。

(2)霉菌和酵母菌总数从初始到7天、14天和28天,霉菌和酵母菌总数不增加。

 

 

重复三次加菌的42天微生物挑战性实验

 

实 验 方 法

重复3 次加菌的微生物挑战试验此方法参照国际CT FA(国际化妆品、香精和洗涤剂协会)推荐的微生物挑战性试验。称取受试样品30g , 每隔1周加菌一次( 即实验的第1、3 和5 周) , 每次加细菌量为1 ×106 ~1 ×107cfu/ g 样品和霉菌1×105~1×106 cfu/ g样品。在加菌后的0 天、7 天和14 天( 后一次加菌前) 采样分析样品中含菌量, 方法同前。

评 判 标 准

此方法可将受检样品分为三类:

( 1)防腐效果优良( W) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 01% ( 即≤100 个/ g或ml) 样品, 通过测试) 。

( 2)防腐效果尚可( M ) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, ( 即≤1000 个/ g 或mL 样品, 通过测试) 。

( 3)防腐效果差( P) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7天或14 天时, 存活菌量>起始浓度的0.01% (不通过测试) 。

实 验 材 料

注:一次加菌和三次加菌实验材料相同

1.培养基

细菌:卵磷酯-吐温80营养琼脂培养基

酵母菌和霉菌:孟加拉红(虎红)琼脂培养基

 

2.生理盐水:称取8.5gNaCl溶于1000mL蒸馏水中,121℃灭菌20min,待用;

 

3.试验菌株

测试用标准菌株:

大肠杆菌(Escherichia Coli),ATCC  8739

绿脓杆菌(Pseudomonas Aeruginosa),ATCC  9027

金黄色葡萄球菌(Staphy Lo Coccus Aureus),ATCC 6538

白色假丝酵母(Candida Albicans),ATCC  10231

黑曲霉(Aspergiblus Niger),ATCC  16404

环境菌:

洋葱伯克霍尔德氏菌( Burkholderia cepacia ,BC),ATCC  25416

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),ATCC  17485等

实 验 过 程

1.混合菌悬液的制备

参考麦氏比浊法配好标准麦氏比浊管,轻摇标准试管。无菌操作下,将活化好的各个菌种加入无菌生理盐水(0.85% NaCl),分别稀释到与标准管相同直径(大小)的无菌试管中。以无菌操作下被测定试管加入无菌生理盐水(0.85% NaCl),直到浓度与所要求的标准管的浓度相同。将各个菌悬液定量加到与标准管相同直径(大小)的无菌试管中形成混合菌悬液。将制备好的混合菌悬液取1mL菌液于含有99mL灭菌生理盐水的锥形瓶中,充分混匀后,制成1:100稀释液。同样方法再从中取1 mL菌液于含有99mL灭菌生理盐水的锥形瓶中,分混匀后,制成1:104稀释液。依序再做稀释1:106;将稀释好的这几个梯度的溶液倒平板计数,最终得到每次加菌的细菌、酵母和霉菌的含菌量,若含菌量未达到或者远远超过标准加入量,则样品需重做。

2.接菌

称取各受试样品30g于灭菌的样品瓶中,加入1%的混合菌悬液, 然后充分混匀, 用封口胶封好样品瓶口,置于28℃左右的培养箱中。在接菌后定期取样分析。

接菌方式采用的是混合接种的方式,并且推荐在标准菌的基础下,加入生产环境菌一起进行挑战性实验,这样可以更加的模拟现实的污染情况,也符合自然界的微生物混生杂居的特点,能够给待测样品带来更佳的质量保证。

结 果 分 析 和 讨 论

受试样品贴布式面膜和润肤乳都含有3个防腐体系,所有样品在进行一次加菌和三次加菌之后,结果见表1-4:

表1  一次加菌的挑战性试验结果(cfu/g样品)

     

0d

7d

14d

21d

28d

贴布式面膜

防腐体系1

细菌

2.86×106

1.5×103

200

<10

<10

酵母和霉菌

5.2×105

2.89×103

750

<10

<10

防腐体系2

细菌

2.86×106

3.04×103

2.45×103

780

100

酵母和霉菌

5.2×105

5.0×103

1.01×103

890

450

防腐体系3

细菌

2.86×106

1.24×103

<10

<10

<10

酵母和霉菌

5.2×105

<10

<10

<10

<10

润肤乳

防腐体系1

细菌

2.86×106

1.37×103

<10

<10

<10

酵母和霉菌

5.2×105

2.9×103

150

<10

<10

防腐体系2

细菌

2.86×106

2.55×103

900

365

<10

酵母和霉菌

5.2×105

7.33×103

1.61×103

750

150

防腐体系3

细菌

2.86×106

<10

<10

<10

<10

酵母和霉菌

5.2×105

<10

<10

<10

<10

表2 三次加菌的挑战性试验细菌结果(cfu/g样品)

   

第一次加菌

第二次加菌

第三次加菌

   

7d

14d

7d

14d

7d

14d

   

1.21×106

1.73×106

1.5×106

贴布式面膜

防腐体系1

1.77×103

220

1.65×103

780

3.13×103

960

防腐体系2

4.11×103

2.2×103

>1.0×105

>1.0×105

>1.0×105

>1.0×105

防腐体系3

1.14×103

<10

<10

<10

<10

<10

润肤乳

防腐体系1

1.53×103

100

1.13×103

150

1.34×103

90

防腐体系2

2.73×103

3.04×103

9.87×103

1.21×104

>1.0×105

>1.0×105

防腐体系3

<10

<10

<10

<10

<10

<10

表3  三次加菌的挑战性试验酵母和霉菌结果(cfu/g样品)

   

第一次加菌

第二次加菌

第三次加菌

   

7d

14d

7d

14d

7d

14d

   

2.15×105

6.0×105

4.5×105

贴布式面膜

防腐体系1

3.3×103

800

1.54×104

520

2.65×103

350

防腐体系2

4.37×103

3.02×103

>1.0×105

4.45×103

>1.0×105

4.9×103

防腐体系3

1.21×103

90

500

<10

350

<10

润肤乳

防腐体系1

1.89×103

300

1.2×103

105

1.34×103

280

防腐体系2

3.0×103

1.54×103

9.22×103

3.1×103

>1.0×105

3.83×103

防腐体系3

<10

<10

<10

<10

<10 

<10

表4 受试样品的两种微生物挑战性实验结果评判对比

样品名称

测试防腐体系

一次加菌

三次加菌

细菌

霉菌

细菌

霉菌

贴布式面膜

防腐体系1

有效

有效

防腐效果尚可

防腐效果尚可

防腐体系2

有效

有效

防腐效果差

防腐效果差

防腐体系3

有效

有效

防腐效果优良

防腐效果优良

润肤乳

防腐体系1

有效

有效

防腐效果优良

防腐效果尚可

防腐体系2

有效

有效

防腐效果差

防腐效果差

防腐体系3

有效

有效

防腐效果优良

防腐效果优良

从一次加菌和三次加菌的试验结果可以看出,防腐体系1-3不管是在面膜还是润肤乳中,都是能够通过一次加菌的微生物挑战性实验的,说明防腐体系1-3是能够有效防腐的;从表4中的两种方法结果评判对比可以知道,防腐体系2虽然能够通过一次加菌的挑战性实验,但其防腐效果差,所以此防腐体系被微生物污染的风险较大。而三个防腐体系中,防腐体系3不管是一次加菌还是三次加菌,都表现出很好的抑菌效果。

 

所以三次加菌的挑战性实验相对来说会更加严格,对产品的防腐体系要求更高,同时对产品的质量更有保证,但三次加菌的实验周期长,操作和工作量也相对多。

各有千秋

两种方法各有各的指导意义,一次加菌的28天微生物挑战性实验能够评判防腐体系是否有效抑制化妆品生产和使用过程中带来的污染;三次加菌的42天微生物挑战性实验能够对产品有效的防腐体系进行防腐能力程度分类,从防腐优良、尚可到差。两种方法结合起来可以更清楚的判断防腐体系的防腐能力,给配方工程师提供更加全面的参考。然而并不是说防腐效能越强越好,因为防腐体系能够抑菌的同时,也会给化妆品带来相应的刺激性和更高的成本。工程师在选择化妆品的防腐体系时应结合实际生产和产品特性等去对防腐体系进行科学的调整。对于新产品防腐体系的测试建议需要进行两种方法的测试之后再结合配方要求和产品特性或者结合刺激性实验和斑贴实验去确定产品的防腐体系。通过对不同类型化妆品的生产工艺和产品使用特点进行研究发现,对于进行防腐体系微调或者希望短期内需要确定防腐体系的化妆品来说,可以通过以下的建议进行测试:一次性快消化妆品,建议进行一次加菌的28天微生物挑战性测试;对于重复多次使用化妆品,建议进行重复三次加菌的42天微生物挑战性测试。

附加实验:针对一次性快消化妆品和重复多次使用化妆品

 

手指残留菌数测试

 

化妆品的种类繁多,有很多的分类方法。按照使用方式分类可分为:一次性快消化妆品和重复多次使用化妆品。一次性快消化妆品是指那些使用寿命较短,消费速度较快的消费化妆品,比如贴布式面膜和一次性湿巾等。重复多次使用化妆品比较多,指使用寿命长,日常重复使用的产品,比如日霜和乳液等。

 

湿纸巾和贴布式面膜生产过程除浸渍液/乳液制备外,还包括衬垫基质材料处理,此类产品微生物污染的危险和可能来源实质上与其他化妆品生产过程和充装过程相似。由于湿纸巾和贴布式面膜生产还包括充液,裁切和封装等工艺。在这过程中,产品与各种设备的表面直接接触,转移操作增加,这样增加了污染的可能性。成卷筒无纺织物储存也易引起污染。要使此类产品达到规定的卫生标准,生产过程和纺织物载体的微生物控制显得更为重要。因一次性快消化妆品使用寿命短,开封用完即可。而重复多次使用的产品需要重复使用,即每次开盖使用都会带来二次污染,包括手部和空气中的菌。我们做过一组关于手指残留菌数的研究,结果如下:

表5   手指残留菌数

 

细菌总数

霉菌总数

涂抹次数(以106菌数计算)

未洗手(极脏)

274

1

3650

洗手

45

1

22000

75%酒精消毒后

4

1

250000

由上可知,在使用过程中,重复多次使用的产品相较一次性快消品来说,被重复污染的情况更为严重。而在生产过程中,贴布式面膜和湿纸巾等产品相较重复多次使用的产品来说,操作工序需有更加严格的质控措施,尤其是无纺织物载体需要彻底进行消毒杀菌。因此在对生产过程的微生物进行严格控制的情况下,对于重复多次使用的产品来说,防腐体系应具有更好的抑菌性能,以及应提前做好防腐体系的防腐效能测试。而一次性快消化妆品在做好生产过程和纺织物载体微生物控制的基础上,防腐体系不应过强,尽量减少过敏率,特别是市场上过敏率较高产品之一的贴布式面膜,更应把握好防腐效能和刺激性之间的平衡。

 

而一次加菌和重复三次加菌两种方法能够给工程师根据不同的配方要求和产品使用特点进行选择性的测试,选择出更合适的防腐体系。微生物无孔不入,建议化妆品在大生产之前应提前做好防腐效能测试,以及模拟生产整个过程进行小试的成品也应进行相应的微生物挑战性测试之后,再进行大批量生产。对于防腐体系微调或者短期内需要确定防腐体系的一次性快消产品,建议进行一次加菌的28天微生物挑战性测试;而重复多次使用化妆品,建议进行重复三次加菌的42天微生物挑战性测试。

 

注:此文已刊登在《HAPPI CHINA》2018·11,如需转载请注明出处。